彼得柏加（Tobey Maguire 飾）終與夢中情人瑪麗簡沃森（Kirsten Dunst 飾）走在一起，紐約市亦掀起了蜘蛛俠熱潮！但一種奇怪的外星共生體，令蜘蛛俠戰衣變成黑色，更暴露出他內心黑暗的一面，同時改變了蜘蛛俠的內在和外表。蜘蛛俠還要對付三位大壞蛋：沙人（Thomas Haden Church飾）、毒魔（Topher Grace飾）與新綠魔（James Franco 飾），當然自己亦要同時對抗心魔。